免疫组化（IHC）常见问题及解答

Q：染色过强是什么原因造成的？
A：1.抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长，可以通过降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间为室温1小时或4℃过夜；
   2.孵育温度过高，孵育温度超过37℃，一般为室温20-28℃；
   3.DAB显色时间过长或DAB浓度过高，所以要注意显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准；

Q：出现非特异性背景染色？
A：1.操作过程中冲洗不充分，可以通过每步操作冲洗3X5的办法；
   2.组织中含过氧化物酶未阻断，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长；
   3.组织中含内源性生物素，可以用正常非免疫动物血清再封闭；

Q：染色弱是什么原因？
A：1.抗体浓度过低，孵育时间过短，可以提高抗体浓度，而且孵育时间不能少于60分钟；
   2.试剂超过有效使用期，尝试重新更换试剂；
   3.操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，要注意每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）；
   4.室温太低，低于15℃，所以若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）；
   5.蛋白封闭过度，注意封闭时间不要超过10分钟；

Q：染色为什么会成阴性？
A：1.操作步骤错误，重新试验，设立阳性对照
   2.组织中无抗原，请设立阳性对照片，以验证实验结果；
   3.一抗与二抗种属连接错误，请仔细确定一抗与二抗种属无误；

免疫印迹（Western blotting）常见问题及解答

Q：为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白？
A：1.你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
   2.你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入PMST，抑制蛋白酶活性；
   3.你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题；

Q：我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？
A：1.有沉淀可能是因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长；
   2.也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量sample buffer即可；

Q：我做的蛋白质分子量很小（10KD），请问怎么做WB？
A：可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移；

Q：我的目的带很弱，怎么加强？
A：可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低；

Q：胶片背景很脏，有什么解决方法？
A：减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，牛奶浓度提高；

Q：目标带是空白，周围有背景，是为什么？
A：你的一抗浓度较高，二抗上HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

Q：我的胶片是一片空白，是怎么回事？
A：如果能能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。
   1.二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；
   2.ECL底物中H2O2，不稳定，失活；
   3.ECL底物没覆盖到相应位置；
   4.二抗失活；

Q：问我显影液显影1分钟,和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢?
A：1.可能是红灯造成的,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.胶片本来就被曝光了；
   2.显影时间过长.

Q：DAB好还是ECL好？
A：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。要看实验的情况。

Q：抗原分子量是资料上的两倍，是怎么回事？
A：抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。在上层胶中加入尿素至8M也可以打开。

Q：半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？什么是短路？如何控制和发现短路呢？
A：一般参照膜>= 滤纸> 胶,转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的， 最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

Q：电泳时Marker 按说明加5ul，但电泳中看不见，是失活了吗？
A：加入20ul即可。

Q：蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时Marker 转上去了，为什么？
A：1.样品浓度过低；
   2.转移时间不够；

Q：我的一抗量较少，同时我也不知道一抗的最佳稀释比例是多少，怎么做呢？
A：确定实验过程无污染后，将含抗体的稀释液回收，保存于-70℃。最好第一次的浓度做高一点，这样，如果结果不好，可以尝试再稀释；

酶联免疫吸附（ELISA）常见问题及解答

Q：重复性不佳怎么办？
A：1.样品数量多少不一，加样时间有长有短，出现时差反应；重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。
   2.移液器加量不一致；尽可能使用同一移液器并装紧移液头。
   3.保温时间不一致、洗涤条件不一致、操作人员不一致；重复测定标本,条件、人员等尽可能与上次保持一致，以排除上述因素造成的主观误差。

Q：出现白板、阳性对照不显色？
A：1.未加底物A或B；注意不要漏加A液或B液。
   2.洗涤液配制有误；按说明书所示稀释倍数配制。
   3.未加酶结合物而认为已加入；注意不要漏加。
   4.某一容器未洗净，残留灭活酶物质；容器一定要清洁，可靠。

Q：花板（终止后整板呈黄色）是怎么回事？
A：1.水质被金属离子等污染；使用新鲜纯水或蒸馏水。
   2.酶加量过多；加酶前验看移液器调节量是否准确。
   3.培养箱温度超过37℃或酶结合物反应时间、底物显色时间过长；放入板以前要验看培养箱温度，准确定时。
   4.洗涤不充分，样品中其他成分残留或酶残留；洗涤液注满微孔，充分洗涤。
   5.样品污染；样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。
   6.移液头重复使用，未洁净或消毒不完全而用于加酶或底物液；防止方法：移液头清洁或消毒一定要彻底。
   7.底物B因保存不当已变色；严密避光保存。
   8.酶工作液污染底物B；板在保温时一定要贴封口胶，酶不要长时间敞口放置。